LNPs 作為遞送系統
為了克服裸露的mRNA轉染的種種問題，已經開發了保護性遞送系統。目前的mRNA疫苗（表 1）都在使用 LNP 技術。這說明了使用LNP能在穩定mRNA 的同時并將其遞送到細胞中。mRNA疫苗中的LNP 由四種主要成分組成（見表1）：中性磷脂、膽固醇、聚乙二醇 (PEG) 脂質和可電離脂質。可電離脂質含有帶正電荷的可電離胺基團（在低 pH 條件下電離），可在顆粒形成過程中與陰離子mRNA 相互作用，并在細胞攝取過程中促進膜融合。此外，PEG化脂質用于控制粒徑并充當空間屏障起穩定作用，防止儲存過程LNP微粒聚集。通過使用微流控混合生產技術，這些脂質成分與 mRNA 一起形成大小約為 60-100 nm 的顆粒。例如，SARS-CoV-2 候選疫苗nCoVsaRNA和ARCoV的平均粒徑分別為75 nm和89 nm。
表一：
LNPs與脂質體的不同之處在于微粒核中存在脂質，來自幾項研究的數據表明水也存在于微粒內部某些空間。這意味著mRNA即使被包封也可能暴露于水性環境中。這種類型的內部結構，先前已在未包載和包載siRNA的LNP中被冷凍電鏡所觀察到。類似地，mRNA-LNPs 的冷凍電鏡結果也顯示了電子致密核，勞氏紫（Thionine）對RNA進行染色用于冷凍電鏡對比度增強（見圖2）。
盡管mRNA-LNP 的共同特征是脂質核，但該核的確切結構特征及其對脂質成分（摩爾比）和 mRNA 定位的依賴性仍存在爭議（見圖3）。正如 RiboGreen檢測實驗所確定的那樣，mRNA 肯定位于 LNP 內部。RiboGreen 是一種染料，當與單鏈 mRNA 結合時會顯示熒光，但不能進入 LNP。在 mRNA-LNP 制劑中，例如mRNA 疫苗的制劑，可與RiboGreen結合產生熒光的mRNA 比例非常低，因此，采用RiboGreen來測定的包封率通常 > 90%。綜上所述，冷凍電鏡（圖2) 和包封率證據表明，mRNA-LNPs形成納米粒子，其中包封了 mRNA，可免受外部介質的影響，LNPs包封的mRNA的結構有3種模型，這些主要來源于siRNA-LNPs分析（圖3）。
圖2 mRNA-LNP 的冷凍電鏡圖像顯示具有明顯不同電子密度的“囊泡"結構
圖3 siRNA-LNP 和 mRNA-LNP 結構的推測模型的示意圖 A：多層囊泡；B：納米結構核；C：均質核殼
mRNA疫苗所包封的mRNA會影響終LNP的結構：siRNA 在結構和分子量大小上與 mRNA 有很大不同（表 2）并且N/P（可電離的陽離子脂質與核苷酸磷酸鹽）摩爾比不同，N/P摩爾比分別為3和6（表 1）。mRNA 至少比 siRNA 大 100 倍，這會影響 LNP 的結構。此外，有跡象表明 mRNA 位于 LNP 的核，而siRNA 更靠近表面，mRNA 可以形成“囊泡"（圖 2）。LNP 囊泡部分的組成是一個有爭議的問題，在這種狀態時：“mRNA 可以從帶電的脂質中解離，留在充滿溶劑的囊泡隔室中"。
表2 mRNA 和siRNA分子之間的差異
mRNA-LNP不太可能是（圖 3A）的多層囊泡模型。它與mRNA-LNP的 TEM結果中電子致密核位置不對應。目前，大多數研究人員認為 mRNA-LNP 貼近核殼模型（圖3 B和C），這意味著納米顆粒具有表面層和無定形的各向同性核。Viger-Gravel等，使用核磁共振光譜證明LNP結構的兩種類型的是可能的。
他們描述了一個被陽離子脂質包圍（圖3B)的包含水孔的無定形核模型。他們還假設中的脂質可以均勻分散，中間有“小水球"（圖 3C）。后者（圖3B和C）跟siRNA-LNPs和mRNA-LNPs在實驗觀察到的結果更吻合。
Arteta等人，使用冷凍電鏡、小角 X 射線散射 (SAXS) 和小角度中子散射 (SANS) 測量 mRNA-LNP 結構模型。他們發現DSPC和PEG化脂質以及部分可電離的陽離子脂質和膽固醇是位于LNP 的表面，可電離的陽離子脂質、膽固醇（取決于其濃度）、水和 mRNA 的主要部分分布在內部。有趣的是，他們的研究表明，各向同性LNP 由24%（體積分數）的水組成。他們指出 mRNA 位于水柱內，水柱被陽離子脂質包圍（如圖4所示）。這意味著 mRNA 至少部分暴露于LNP 內部的水中，這可能導致mRNA在非冷凍條件下儲存時不穩定，Sebastiani等人也報道了類似的結果。
因此，研究 mRNA 如何與 LNP 中的水和可電離的陽離子脂質相互作用是一件很有趣的事。mRNA 是親水的，它可以通過靜電和氫鍵與可電離的陽離子脂質相互作用（通常表觀pKa < 6.5）。這取決于 LNP 內部的pH值，如果 LNP 外殼對質子具有滲透性——這很可能，因為 2-(對甲苯胺基)-6-萘磺酸 (TNS) 和勞氏紫等離子化染料可以進入 LNP ，那么LNP內部的pH值與制劑的其余部分應該相似，約為7 到 8，這意味著大多數可電離的陽離子脂質將不帶電。
然而，由于可電離的陽離子脂質堆積在中，它們可能表現出聚電解質行為，導致 Henderson-Hasselbalch 方程的偏差，即滴定曲線的“拖尾"（脂質膜內的可電離脂質的表觀pKa可能與實際值有較大偏差，這意味著pKa為6.5左右的可電離脂質在脂質膜內的表觀pKa可能與理論值有1~2個pKa單位的偏差，所以pKa為6.5左右的可電離脂質在pH值為7-8之間的脂膜內時，依然有可能絕大部分呈現帶正電的狀態，注：紅色斜體部分是對一些較復雜概念的進一步解讀，后同）。此外，mRNA 和可電離的陽離子脂質之間的相互作用可能會影響電離行為。
對于 siRNA，發現與可電離陽離子脂質存在較弱的靜電相互作用，這表明至少對于 siRNA-LNP 制劑，內部的pH值接近或等于外部的pH值。對于 mRNA-LNP，尚未進行此類實驗研究。mRNA 和陽離子脂質復合的分子動力學模擬研究證明了脂質-脂質簇和脂質-mRNA 簇的形成。靜電力和氫鍵都在驅動陽離子脂質和 mRNA 的相互作用。
圖4 mRNA-LNPs中mRNA-水柱的示意圖
Arteta 等人的另一個有趣發現是他們的mRNA-LNP 的外殼是單層的。其他研究人員根據冷凍電鏡（圖 2）或 SANS結果分析提出，mRNA-LNPs 的外殼由一個或多個雙層組成。這些相互矛盾的發現表明，使用這些技術評估mRNA-LNP 殼的性質是困難的，可能存在多種類型的mRNA-LNP 結構，其結構取決于脂質的性質和mRNA-LNP 的制備方法。反過來，不同的結構可能會對不同配方的穩定性產生影響。總之，問題仍然在于目前我們尚不清楚 mRNA-LNP 的結構以及包封的mRNA 與各種脂質成分之間的相互作用。
對各種 mRNA疫苗成分的分析表明，它們具有共同特征，但也存在差異（表 1）。LNP 配方、修飾核苷的使用、高GC含量以及常規 mRNA 和 SAM 疫苗之間的長度差異可能會影響這些 mRNA疫苗在儲存過程中的物理和化學穩定性。
